眼见太子登基大典将近，而李选侍仍赖在乾清宫不出，杨涟心急如焚，又联络诸大臣聚集慈庆宫，要大学士方从哲带头请太子下诏驱李选侍移宫。方从哲却不以为然地说：“迟亦无害。”杨涟辩争道：“昨以皇长子就太子宫犹可，明日为天子，乃反居太子宫以避宫人乎？”当时，有人提出李选侍是光宗的旧人，逼之太急是否有失体统。杨涟立即斥之道：“诸臣受顾命于先帝，先帝自欲先顾其子。”并且表示“能杀我则已，否则，今日不移，死不去。”其他大臣亦纷纷赞言助之，词色俱厉，惊动了殿中的太子。太子遣人斥群臣退去，杨涟仍不肯服从，继续抗辩道：“选侍阳托保护之名，阴图专擅之实，宫必不可不移。”在杨涟等的坚持下，朱由校只好下旨遣李选侍即日移宫。李选侍接旨，知败局已定，只好哭哭啼啼地迁出乾清宫，朱由校正式登基，即明熹宗。
从朱常洛驾崩到朱由校登基，前后不过六日，杨涟为辅佐太子顺利登基呕心沥血，几乎是夜夜不寝，史书上称在六天内“涟须发尽白，帝亦数称忠臣”。不久后，杨涟升任兵科都给事中，当时御史冯三元等极力诋毁熊廷弼，杨涟公正疏陈此事。不久后，他弹劾兵部尚书黄嘉善八大罪，黄嘉善遭罢免。
然而，这位在杨涟等正直朝臣舍命扶持下才得以登基的朱由校，并没有像东林党所希望的那样革除弊政，相反却是变本加厉，更加荒淫奢靡、昏庸无能。宦官魏忠贤和朱由校的乳母客氏相勾结，在宫中独揽大权，肆意为虐，一些官吏纷纷投靠魏忠贤，结成“阉党”，打击和排斥东林党人。杨涟怀着满腔的悲愤，决心挺身而出，讨伐魏忠贤。
杨涟将写好的奏疏藏在怀里，准备趁早朝时面奏朱由校，当场揭露魏忠贤。不巧当日免朝，杨涟“恐再宿机泄”，只好交会极门转呈朱由校。杨涟在奏疏中列举了魏忠贤的二十四条罪状，揭露他迫害先帝旧臣、干预朝政，逼死后宫贤妃，操纵东厂滥施淫威等罪行，最后指出魏忠贤专权的恶果是“致掖廷之中，但知有忠贤，不知有陛下；都城之内，亦但知有忠贤，不知有陛下”。请求朱由校“大奋雷霆，集文武勋戚，敕刑部严讯，以正国法”。
杨涟此疏，字字句句，如雷霆万钧，击中魏忠贤的要害，魏忠贤闻疏后惊恐万状，慌忙跑到朱由校面前哭诉其冤，并利用朱由校不识字的缘故，削减罪状。弄得朱由校真假难辨，好坏不分，反而温言抚慰魏忠贤，“严旨切责”杨涟。自此以后，魏忠贤对杨涟恨之入骨，魏忠贤矫旨责杨涟“大不敬”、“无人臣礼”，将杨涟革职为民。
挤走了杨涟，魏忠贤仍不肯善罢干休，必欲置之死地而后快，指使“阉党”大理丞徐大化弹劾杨涟、左光斗“党同伐异，招权纳贿”，借兴“汪文言之狱”谋害杨涟等人。锦衣卫北镇抚司指挥许显纯在魏忠贤的授意下对汪文言严刑逼供，要他诬陷杨涟受贿，汪文言宁死不屈，仰天大呼道：“世岂有贪赃杨大洪哉。”许显纯无计可施，只好自己捏造供状，诬陷杨涟、左光斗曾受辽东经略熊廷弼贿赂二万两，魏忠贤立即遣锦衣卫缇骑前去逮捕杨涟等人来京审讯。
杨涟被逮押送北京，沿途群众闻讯，皆为杨涟鸣不平，他们自动夹道哭送，所过村市，“悉焚香建醮，祈佑涟生还”。当时，在知府李行志、知县夏之彦等的倡议下，“四门设柜，捐俸首倡。士民好义者，倾家乐助，更属僧道，遍化吴楚申浙诸省”，但最终只筹集了一万余两。
杨涟被下镇抚司诏狱审讯，许显纯将锦衣卫的诸多酷刑一一用于杨涟，折磨得他遍体鳞伤，气息奄奄，后来提审时杨涟被折磨得无法坐、立，许显纯便让打手给杨涟带上桎梏，拖他到堂上躺在地下受审。杨涟仍不屈服，在狱中写下《绝笔》，继续陈述“移宫案”的真相，痛斥魏忠贤紊乱朝纲，魏忠贤得知后气得七窍生烟，令许显纯立即杀掉杨涟。
许显纯令缇骑在狱中处死杨涟，此贼先后以“土囊压身，铁钉贯耳”等手段加害杨涟，但杨涟并未身亡，许显纯以一枚大铁钉钉入杨涟头部，终将其害死，时年五十四岁。临刑前，杨涟咬破手指，写下血书一封，称“欲以性命归之朝廷，不图妻子一环泣耳！”写完仰天大笑。
杨涟之子杨之易、杨之赋向朝廷鸣冤，杨涟冤案得以平反，明毅宗朱由检“追录死阉忠臣”，以杨涟为首，追赠他为太子太保、兵部尚书，谥号“忠烈”，赐祭葬，并任命他的一个儿子为官。
杨涟在“红丸案”、“移宫案”和以魏忠贤为首的阉党的斗争中表现突出，对明末天启政局的发展起到了重要的作用。“红丸”、“移宫”两案，直接关系到皇位的继承和皇权利益的再分配，杨涟在两案中表现积极，起到关键作用，尤其是“移宫”中，杨涟出力最多。“移宫”之后，朝廷一度出现了“众正盈朝”的良好局面，杨涟于其中，居功至伟。